背景介绍
出生缺陷是婴儿期死亡的主要原因，并且是所有年龄段发病率的重要来源，其中大部分病例在怀孕期间被发现。出生缺陷的病因很复杂，拷贝数变异（CNV）目前是胎儿和儿童出生缺陷最常见的原因。实际上，在具有结构缺陷的胎儿中，亚显微致病性或可能致病性CNV的检出率为5.5-10.5％。CNV为出生缺陷的常见原因这一事实表明，较小的遗传病变，如点突变，也可能对其发病机制产生实质性影响。
与出生缺陷相关的大多数致病性CNV都是新发变异。在已经确诊的遗传病案例中有一半以上都是新发突变导致，与较轻微的出生缺陷相比，新发突变可以解释更大比例的严重出生缺陷病例。经典研究已经证实，隐性复合杂合突变也可以解释动物模型中大部分致命的发育缺陷。基于这些考虑，我们推测遗传自父母的复合杂合突变和新发突变，正如CNV一样，可以解释相当比例的严重异常胎儿病例的遗传学病因。为了验证这些假设，我们在一系列严重异常胎儿中进行了全外显子组测序（WES），我们试图评估WES在产前临床诊断的价值。
材料与方法
名胎儿或死产胎儿需要符合以下条件之一
（一）至少表现为两种及以上主要的畸形；
（二）严重的脑室扩大和/或脑结构畸形；
（三）与围产期致死率高风险相关的异常现象；
以上病例经过核型（n=58）和基因芯片（n=84）未发现解释临床表型的遗传学原因。从脐带，其他胎儿组织，羊水细胞或绒毛膜绒毛中提取基因组DNA用于后续基因检测。83个样本进行了一家三口（trio）全外显子测序，18个进行单人全外显子检测（这些都为近亲家庭，游侠提示寻找近亲家庭的纯合突变可不测父母）。
位点质控标准：测序深度大于等于10X，至少4条reads支持突变，突变丰度达到20%以上。
位点筛选标准：内部人群数据库、千人基因组数据库、EVS数据库人群频率小于0.5%（这也是游侠一直推荐的cutoff值），所有新发突变位点都在IGV中确认父母的基因型，以排除假阳性位点（上海寻因自主开发了XYAutoFilter可不借助IGV，更高效率识别新发突变）。
结果
我们研究了主要发生在妊娠中期的例严重异常的胎儿病例。我们根据其表型将这些病例分为六类：
（一）孤立性双侧肾发育不全(n=11)；
（二）VACTERL（椎体缺损，肛门闭锁，心脏缺陷，气管食管瘘，肾脏异常和肢体异常）(n=9)；
（三）脑异常（n=36）；
（四）疑似纤毛病（n=5）；
（五）多种畸形的各种模式（n=32）；
（六）胎儿运动不能（n=8）；
对于每种类型的异常，我们接下来确定WES数据中是否包含与已报告的表型相关或可能相关的已知疾病基因中的罕见的新发突变或遗传自父母的复合杂合突变。我们还寻求在多个散发家系中或其在模式生物中的已知功能来寻找候选基因。
肾脏发育不良
我们研究了8例孤立性双侧肾发育不全的散发病例，所有这些病例都是男性。此外，我们研究了2个病例（两个女性和一个男性），双侧孤立多囊肾，没有任何下尿路梗阻的迹象。在这些病例中未发现CAKUT已知致病基因的新发突变和复合杂合突变。
我们在两个散发的双侧肾发育不全的病例中鉴定了GREB1L基因中的新发突变，超声显示患儿的父母正常，其中一个是软件预测有害的错义突变，还有一个无义突变。GREB1L与染色质结合的雌激素受体辅激活因子GREB1具有一定的相似性。在斑马鱼的GREB1L基因同源基因发现一个无义突变导致膀胱膨胀异常，这可能是Hedgehog信号通路异常的表现。有趣的是，Shh中的种系突变导致小鼠肾发育不良。
VACTERL
我们研究了9个具有至少两个VACTERL关联特征的病例（OMIM），包括至少一个核心特征（肛门直肠或气管食管缺损）。我们在一个胎儿中CHD7基因上发现一个新发的无义突变。据报道，CHD7中的新发突变导致CHARGE综合征（眼睛缺损，心脏缺陷，胆管闭锁，生长和/或发育迟缓，生殖器和/或泌尿系统异常，耳部异常，耳聋等）。在另一个胎儿中DSTYK基因上发现一个新发的无义突变，该基因导致CAKUT，其他案例未发现已知基因的致病突变。
脑异常
我们研究了36例主要结构性脑异常的胎儿病例，其中8例也至少有一项主要的周围神经系统异常。总之，我们在7个基因中发现了8个突变。
有趣的是，这些突变中的四个会影响编码微管蛋白的基因。由于在这八个胎儿中观察到的表型有些非特异性，因此临床医生不容易怀疑这些突变。
畸形提示纤毛病
我们研究了五例具有下列ciliopathies特征的胎儿：枕部脑膜膨出，大/高回声肾和蚓部发育不全。这些胎儿中有4个是已知纤毛病基因中致病性或可能致病性变异的复合杂合突变(CEP(OMIM642),TCTN1(OMIM),TMEM67(OMIM),andBBS10(648))。
多发畸形
我们研究了32例至少有两种主要畸形的病例（模式与其他类别中的模式不一致）。我们认为其中六个（19％）由已知疾病基因的突变所解释，包括FRAS1(OMIM),FLNB(OMIM),FAM20C(OMIM),TGFBR1(OMIM),EP(OMIM),andMNX1(OMIM)。
候选新基因
胎儿--BEV出现与脊椎节段缺陷相关的脊柱侧凸。由于这个胎儿父母是近亲结婚，我们把注意力集中在纯合变异，其中，我们在FKBP8基因中发现了一种罕见的，预测有害的错义突变，有趣的是，Fkpb8突变小鼠显示出椎骨的广泛融合，这表明在胎儿中观察到的分割缺陷也是由该基因的破坏引起的。胎儿CONGE-在妊娠中期出现多种异常，包括短肢畸形，我们发现该胎儿在VEFGA基因上携带一个新发的无义突变，VEGFA编码关键调节血管发育。值得注意的是，在11和12.3天之间，小鼠胚胎中单个Vegfa等位基因的死亡是致命的。这些胚胎显示早期血管发育受损和多种结构异常，由于早期的致死性，这些特征仍然很不清楚。
胎儿运动不能
我们研究了七个散发家系中的八个运动不能胎儿，我们鉴定了近亲家庭中的两个兄妹中的RYR1（OMIM）的致病纯合突变和另一个散发家系的复合杂合突变。RYR1的隐性突变主要与儿童期出现的肌病有关，但先前在一些患有运动障碍的胎儿中已有描述。其他案例未发现已知基因内的候选致病突变。
讨论
严重异常胎儿的发现给临床提出了其预后和二胎复发风险的关键问题。临床医生通常在发现胎儿主要异常后进行产前染色体微阵列分析测试，以便确定疾病的原因并确定精确的预后。虽然染色体微阵列分析的诊断率相对较低，但它是目前研究胎儿结构缺陷的最有力的检测。本研究的目的是评估全外显子测序用于调查这些异常的附加值。通过招募主要终止妊娠的病例，我们旨在丰富我们的严重异常队列，同时补充他们的表型特征与病理数据。在我们的研究中获得的诊断率（19%）类似于最近在类似研究中获得的结果。在一些情况下，表型不是特定到足以判断疾病诊断。这种表型特异性的缺乏代表了产前诊断的主要挑战，并且由几个因素来解释，包括胎儿和我们有限的产前临床表型知识。因此，对胎儿异常的系统基因组研究将提供对在胚胎或胎儿生命期间起作用的许多基因的独特功能的洞察，同时增强基因组测序在产前诊断中的应用价值。
游侠点评
全外显子测序在产前的应用是一个全新的领域，目前还在科研探索阶段，这非常像当初儿童智力低下基因检测，原来基因芯片获得10%左右的诊断率，后来逐步使用全外显子测序可以获得更多的诊断率，可以预见的是全外显子测序在产前的应用是一个逐步的过程，国内一些有实力的产前诊断中心已经在探索，比如广州市妇女儿童医疗中心，我们开发了能够快速准确分析新发突变和复合杂合突变以及外显子水平缺失重复的CNV分析算法，欢迎有志于在产前寻找遗传病因的课题组合作。
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