研究进展
期刊:CellularandMolecularGastroenterologyandHepatology
标题:GATAControlsEpithelialMorphogenesisintheDeveloping
StomachtoPromoteEstablishmentofGlandularColumnar
Epithelium
DOI:10./j.jcmgh..05.
背景与目的:转录因子在初生的前肠内胚层中广泛表达。随着发育的进展，gata在食管和前胃的复层扁平上皮中消失，而在后胃的上皮中维持。这些区域内gata的差异表达与不同组织形态发生事件的发生相吻合，提示gata在前肠内胚层向食管/纤维和上皮组织分化中的作用。本研究的目的是确定gata如何调节小鼠胃上皮细胞的差异形态发生。
方法：用aGata条件敲除小鼠系在发育中的HS中消除GATA，在发育中的FS中用aGata条件敲入小鼠系表达GATA。
结果：我们发现GATA缺陷的HS上皮具有FS样命运，而表达GATA的FS上皮则具有HS样命运。这些上皮的潜在结构变化是GATA直接激活或抑制HS或FS定义转录本表达的基因表达网络的广泛变化。我们的研究表明，在HS发育过程中，GATA在抑制食管/FS转录因子网络以促进柱状上皮的过程中起主要作用。此外，发育突变体中依赖GATA的表型反映了与Barrett食管相关的基因表达的变化。
结论：GATA是激活胚胎胃单层柱状上皮而不是复层鳞状上皮发育的必要条件和充分条件。此外，突变体和巴雷特食管之间的相似性表明，发育生物学可以为人类疾病机制提供洞察力。
小鼠胃由两个功能区组成：前胃(FS)由类似食道的角化复层鳞状上皮组成，后胃(HS)由简单的柱状上皮组成。HS由腺体(体部)和窦部组成。体表含有丰富的壁细胞和产酶细胞，而胃窦上皮主要由粘液细胞和分泌胃泌素的G细胞组成。1，2尽管不同的HS和FS上皮结构的发育对消化至关重要，每个结构都包含特殊的细胞类型，但在调节区域化的分子途径方面仍存在差距。这些结构域的建立和维持对于胃肠道(GI)的动态平衡至关重要。例如，在Barrett食管(BE)中，食管复层鳞状上皮转变为具有肠和胃特性的简单柱状上皮。3很明显，明确GI内离散区域的区划和维持所需的分子机制是了解包括BE在内的GI疾病的关键一步。
在胚胎发育过程中，胃肠道上皮由内胚层发育而来。由进化上保守的信号通路驱动的形态发生事件直接将肠管前后区域化为SOX2塔前肠和CDX2塔中肠和后肠。随着发育的进展，前肠被模式化成原始的器官区域，食道、腺胃和近端肠道的上皮衬里的多样性在形态学上变得明显。虽然还不完全了解，但食道、腺胃和肠上皮的特化和分化是由基因调控网络驱动的，这些基因调控网络涉及在胃肠道疾病中通常被发现沉默或扩增的谱系限制性转录因子，包括CDX2、SOX2、TRP63和GATA因子和6.-10。
含有转录因子GATA的锌指对许多胃肠道器官的发育至关重要，包括腺胃和小肠，并且在BE和食管癌、胃癌和结直肠癌中异常表达。11-20GATA的锌指结构域与启动子和增强子中的共识(A/T)GATA(A/G)序列的结合调节基因的表达。21GATA和其他转录调节因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用进一步影响组织特异性和。例如，GATA的N端锌指与非DNA结合的GATA的辅助因子FriendofGATA(FOG)蛋白之间的相互作用有助于多种组织中的基因表达程序，包括心脏、胃肠道、生殖道和肺。22GATA-FOG相互作用的中断可能会干扰器官的发育和功能。
在小鼠发育的E8.5和E10.5之间，GATA在尾部前肠内胚层中表达。18,23,2由E11.5-E12.5表达，然而，GATA在前肠内胚层中丢失，导致食管和食管复层扁平上皮的形成，而在前肠内胚层中维持，导致了HS的不同单层柱状上皮。18GATA在这些区域中的表达与组织发生分化的开始相吻合，这表明GATA在这一发育过程中起了作用。进一步支持GATA作为一个模式因素的作用是我们先前的工作证明GATA对于定义肠空肠/回肠连接是必不可少的。此外，野生型和GATA-/-胚胎干细胞嵌合小鼠胃的组织角色塑造显示GATA-NULL区具有壁细胞、发酵主细胞和颈细胞标记基因的复层上皮表达缺失特征。18.另外，用一只表达了结雾缺陷GATA蛋白的小鼠进行的研究表明，GATA-FOG的相互作用与近端小肠末端回肠基因表达的抑制有关。26.另外一项研究也发现了相同的种突变体，这些突变体都有助于促进人类的发展。27条件性GATA基因在发育晚期小鼠胃的远端区域通过PDX1-CREREULST表达FS和胰腺基因进行消除。19.这些小鼠模型为研究腺胃发育后期对GATA的需求提供了依据。GATA蛋白在前肠发育早期的作用尚未完全确定，在这个时期具有不同上皮结构的结构域首次被描绘出来
这项研究探讨了gata作为一个区域化因子，是必要的和足够的直接形态发生的单层柱状上皮，而不是在早期胃发育的复层扁平上皮。我们使用条件敲除(cko)方法在hs开发过程的早期消除gata，并使用条件敲入(cki)方法在开发fs中保持gata表达。我们发现gata通过激活一个对单柱状腺上皮细胞命运至关重要的基因网络的表达，同时抑制一个对分层上皮细胞至关重要的基因网络，从而在发育过程中驱动一个分子程序包括许多食管富集转录因子。对gata6突变体的平行研究表明，gata突变体的表型特异性归因于gata。最后，我们观察到gata突变体在全球转录组中的变化，这些突变体与化生基因标记重叠，表明在上皮细胞发育过程中确定gata的直接靶点可以深入研究。
在胚胎发育过程中，由区域限制性转录因子和线性特异性转录因子组成的基因调控网络调节胃肠道上皮的规格、形态发生和分化。我们的目标是了解GATA，一个关键的发育中表达的转录因子，如何参与小鼠胃上皮的发育和分化形态发生。我们使用GATA条件基因敲除和敲入小鼠品系的研究支持了GATA对于胃中柱状上皮形态发生的必要性和充分性的结论。GATA6条件基因敲除胚胎胃上皮形态发生正常，提示GATA是唯一控制这一过程的基因。GATA必须在发育中的HS中表达，以允许柱状胃上皮细胞的命运，并抑制复层鳞状上皮细胞的命运。相反，GATA必须在发育中的FS中沉默，以允许层状鳞状上皮细胞命运和阻止柱状胃上皮细胞命运。通过这种方式，在发育中的小鼠胃中建立差异表达GATA的结构域决定了胃上皮的形态发生。
我们的研究与Jacobsen等人18和Rodriguez-Sguel等人之前发表的结果一致，并对其进行了扩展。19这两项研究都提供了发育胃中依赖GATA的表型的初步组织学特征，并表明在GATA突变的胃中腺柱状上皮结构和成熟的HS细胞类型是异常的。推进这些研究，我们的研究发现了发育早期的胃缺陷(E1.5vsE17.5-E18.5)，使用CKO和CKI模型来证明GATA在柱状HS发育中的必要性和充分性，并增加了深入的全球转录和DNA结合分析，以增强对GATA在胃生物学中作用的理解。然而，我们研究的一个警告是，尽管我们的分析时间是基于有效的GATA蛋白丢失和形态表型的出现，但我们不能排除E1.5之前的分子变化影响表型的可能性。
然而，简单地识别GATA突变体中表达上调或下调的基因本身并不表明GATA直接调控了基因的转录。鉴定DEGS调控区域内的功能性GATA结合位点可以在GATA和其假定的靶标之间建立可能的直接调控关系。与GATADNA结合数据重叠的表达数据使我们能够在实验验证的GATA结合位点和我们模型中的DEG之间建立联系，以确定在发育中的小鼠胃中最有可能受到GATA直接调控的候选基因。这项分析的一个警告是，我们使用的是成年小鼠HS上皮细胞的结合数据，而不是E1.5胚胎的结合数据。虽然使用胚胎细胞很理想，但我们遇到了技术挑战。我们的分析可能在成年HS中发现了GATA结合的靶标，而在发育中的胚胎组织中GATA没有类似地结合GATA(假阳性)，而且由于一些靶标只在发育过程中与GATA结合(假阴性)，GATA结合峰被遗漏了。然而，来自成人组织的数据可以作为替代，证明GATA能够与简单柱状HS上皮中的特定染色质结构域结合。支持使用成人组织的CHIP-SEQ数据来探索胚胎组织中GATA功能的有效性的发现是，GO术语表示具有与发育相关的生物学功能的GATA结合位点的基因。GATA结合位点与这些主题的关联进一步支持了GATA是腺HS柱状上皮发育的关键调节因子的观点。突变体中差异表达的HSE和FSE基因与实验验证的GATA结合位点之间的相关性将GATA直接置于介导柱状HS发育所必需的大基因网络的上游。
Gata因子，特别是gata，在其他发展系统中被认为是主控调节器。Gata和gata6是肠道发育的关键调节因子。1gata通过激活空肠细胞相关基因的表达和抑制回肠细胞相关基因的表达发挥肠道区域化因子的功能。17gata激活引导心脏发育的转录因子网络中关键蛋白的表达。5就抑制功能而言，gata2/3通过抑制干细胞中的多能性因子来调节促进滋养细胞分化的转录因子网络。55gata1通过抑制逆向转录促进红细胞分化这些gata1功能的双重作用机制对谱系规格具有协同作用，导致红系分化而非髓淋巴分化。在半数以上的食管/转录因子基因组的启动子中发现了gata结合位点，而且这些转录因子的表达与gata的存在或缺失有关，这些事实表明gata直接抑制转录因子网络的表达以抑制复层扁平上皮的发育。此外，这些食管/fs转录因子的下游靶点也包含gata结合位点和根据gata的存在或不存在而改变的表达状态。总之，这些数据支持gata通过协同机制抑制hs复层扁平上皮发展的想法。
利用从交叉引用表达、染色质结合和基序分析中获得的信息，我们确定了可能有助于GATA特异性激活或抑制转录的辅因子。3-39例如，TBX5和GATA共同结合心肌细胞中的基因来激活基因表达。3-36SF1和GATA协同作用激活Sertoli细胞的基因表达。37，38虽然SP3和GATA一样，可以激活或抑制基因表达，但57，58GATA和SP3可以相互作用来激活心脏Carp1的表达。37，38尽管SP3和GATA一样，可以激活或抑制基因表达，但57，58GATA和SP3可以相互作用来激活心脏Carp1的表达。37，38虽然SP3和GATA一样，可以激活或抑制基因表达，但57，58GATA和SP3可以相互作用来激活心脏Carp1的表达。SP1和GATA正向调节心脏和肠道基因的表达。59-61虽然还没有与GATA连锁，但ZNF35C(ZFP35C)含有KRAB转录抑制域。2，3PKNOX1优先与启动子序列结合，抑制成脂分化，并参与GLUT基因的负调控。-6BORIS(印迹位点调节基因的兄弟)负调控雄激素受体。我们提出这一机制是GATA抑制小鼠空肠中Fgf15基因的一种方式。
在GATA突变胚胃中观察到的从层状上皮到柱状上皮和柱状上皮到复层上皮的形态和分子变化使人联想到组织化生。63层状到柱状上皮化生与胃肠道特别相关，因为食道中的Barrett化生是食管腺癌的癌前危险因素。12，13，20我们最近对人食管癌细胞株的体外研究表明，GATA的表达对酸和胆汁有反应，当过度表达时，GATA抑制了分层的细胞相关基因的表达，包括Trp63，Krt5和Krt15.20。BE和GATA突变体中失调的基因表达模式之间的相关性，以及我们发现这些基因中的许多基因在这些基因的过度表达时，会抑制分层的细胞相关基因的表达，包括Trp63，Krt5和Krt15.20BE和GATA突变体中失调的基因表达模式之间的相关性，以及我们发现这些基因中的许多基因在过度表达时抑制了包括Trp63，Krt5和Krt15.20在内的分层细胞相关基因的表达。我们认为GATA通过激活或抑制基本柱状和层状鳞状细胞相关转录因子及其靶点的表达来调节多种BE相关途径。例如，在BE中上调的柱状细胞相关转录因子FOXA2和在BE中下调的层状鳞状细胞相关转录因子Tfap2c都含有功能性的GATA结合位点，并且在表达GATA的FS中被错误调控，FOXA2被诱导，Tfap2c被抑制。6，65最近研究表明，这些特定的转录因子在多个BE表达研究中都发生了一致的变化，FOXA2被激活，Tfap2c被抑制。由此得出的相关性可能更接近胃型化生，而不是肠型化生。虽然我们提出，像我们这样的发育研究有助于我们对疾病的理解，但我们不能肯定地得出结论，GATA参与了疾病的发病机制。使用成年小鼠食道中GATA诱导的小鼠或其他模型，如人类细胞或器官培养的小鼠进行进一步的研究。GATA在正常组织和BE组织中的表达对于理解GATA在BE中的作用至关重要。
在我们的论文被修订的同时，川口小组发表了一项补充我们的研究，考察了SOX2和GATA在小鼠胃发育过程中的关系。66他们的研究支持了我们在这里报道的发现，证明了GATA在指定发育中的胃中的柱状上皮方面发挥了重要作用。我们的研究为理解GATA是如何在胃上皮细胞发育过程中作为一个重要的模式因子发挥作用增加了分子机制的深度。通过将形态学组织分析与无偏见的、全局的基因表达和染色质结合的方法相结合，我们将GATA置于定义柱状上皮细胞特性的转录级联的顶端。GATA激活了大量基因的表达，这些基因对柱状上皮细胞的形态形成和分化为成熟的上皮细胞类型至关重要。同样重要的是，GATA通过直接抑制基本的鳞状细胞模式转录因子及其靶标的表达，来决定柱状上皮细胞的命运，但此前并未得到很好的认识。总体而言，我们的数据支持GATA作为一个重要的细胞自主转录调节因子在HS上皮发育过程中发挥作用。
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